食用菌菌种分离方法有四种，即组织分离法、孢子分离法、耳木分离法和土中菌丝分离法。
（一）组织分离法
组织分离法是利用子实体内部组织来获得纯菌种的方法，根据不同的分离材料大体可分为三种。
1、子实体组织分离
①、种菇的选择 从优良的品系中选取优良的个体作种菇，以单生菇、菇形圆整、无病虫害菇作分离材料。
②分离 把种菇带入接种箱内，用75%酒精表面消毒，用解剖刀在菌柄中部纵切一刀，然后撕开，挑取菌盖与菌柄交界处的一小块组织，接种到PDA培养基上，数天后就可看到燃态颤组织块及培养基上有白色菌丝，即表明分离成功。
2、菌核组织分离 茯苓、猪苓、雷丸等药用菌，常利用菌核分离得到菌种。分离方法是将菌核表面消毒后，用解剖刀切开，取中间组织1小块，接入PDA培养基上，20℃―25℃培养。
3、菌索分离 密环菌，假密环菌常用菌闭耐索来分离。方法是将菌索表面消毒后，去掉菌鞘，把白色菌髓部分用无菌剪刀剪成小段。移接在PDA培养基上，20℃―25℃培养，有白色菌丝长出且无污染，即表明分离成功。
（二）孢子分离法
孢子分离法是利用菌类的成熟孢子能自动弹射的原理，在无菌操作条件下，使孢子在适宜的培养基上萌发长成菌丝体而获得菌种。
1、种菇的选择 孢子分离用的形态不同，孢子分离的方法也不同。
①整菇插种法：是将整只成熟度适当的种菇，经表面消毒后，插入孢子采集器内，放在适当的温度下，让其弹射孢子的方法。蘑菇、香菇、草菇等食用菌常用此法采集孢子。
②钩悬法：将新鲜的成熟度适当的耳片用无菌水冲洗后悬挂在无菌的三角瓶内或有孔钟罩内，在一定温度下让其弹射孢子。木耳、银耳常用此法采收孢子。
（三）、耳木（菇木）分离法
耳木（菇木）分离法是利用耳木或菇木中的菌丝体得到菌种的方法。
1、耳木的采集与选择 一般在该菌的生长季节里，选取生长的子实体大、肉质厚、成熟度适当、无杂菌感染的耳木或菇木进行分离。
2、分离方法 在所选耳棒长有子实体的部位，横断面锯下锯成1cm厚薄的木片，带入已经消毒的接种箱（或接种室）内。将上述木片浸入0.1%升汞溶液中30s―60s，用无菌水冲洗数次，以冲去残留的升汞液，放在无菌纱布上吸干水分，多面手用灭过菌的榔皮败头，解剖刀切去树皮部分，把木片劈成小块，随后用镊子将小木块放入PDA培养基上，每管放一块，放适宜温度下培养。
（四）土中菌丝分离法
它是利用菌类地下的菌丝体来分离得到菌种的一种方法。主要用于腐殖质腐生菌的分离，用前述三种方法能分离得到菌种，一般不采用这一方法。但在野外采集时，菇类子实体已腐烂，而又十分需要该菌种时，就要用此法分离。具体操作如下：
①取菇体下与菇根相连的菌丝体，尽可能取较清洁的菌丝束。
②由于土壤中含有各种微生物，如细菌、放线菌、霉菌等，因此分离时要用无菌水反复冲洗菌丝束，把附着的泥土等杂物冲洗干净，把无菌棉花或纱布吸干水分。
③取菌丝束尖端部分，接入有细菌抑制剂的培养基中，25℃左右培养，无杂菌污染即分离成功。
④菌丝的鉴定。在土中获得的菌丝，其可靠性较小，必须经过出菇鉴定，才能确认是该菌的菌种。 接种后的原种或栽培种全部拿出培养箱或培养室，根据不同食用菌菌丝发育最适温 度进行培养。培养2～3天后，菌丝开始生长时，要每天定期检查，如发现黄、绿、橘红、黑色杂菌时，要及时拣出清理。尤其是塑料袋菌种，检查工作到菌丝长满为止。培养室切忌阳光直射，但也不要完全黑暗；注意通风换气，室内保持清洁，空气相对湿度不要超过65%；同时菌种瓶、袋不要堆叠过高，瓶间要有空隙，以防温度过高造成菌丝衰老，生活力降低。特别是对加温的培养室要注意：一要保持室内温度的稳定，因在温差较大的情况(特别是母种培养)会形成冷凝水，而使菌丝倒伏变黄。有条件的话，可根据菇类的菌丝生长对温度的要求，按品种分开放在不同温度的培养室(箱)内培养。同时要注意经常调换原种、栽培种排放的位置以使同一批菌种菌丝生长一致。二要注意通风换气，以免室内二氧化碳浓度过高而影响菌丝生长。